先天性维生素K依赖性凝血因子缺乏症1细胞诊断体系的构建
Zhonghua yi xue yi chuan xue za zhi = Zhonghua yixue yichuanxue zazhi = Chinese journal of medical genetics(2020)
摘要
目的:建立可用于确诊先天性维生素K依赖性凝血因子缺乏症1(vitamin K-dependent coagulation factor deficiency 1,VKCFD1)疾病的细胞体系。方法:在稳定表达报告基因FIX-Gla-PC的HEK293细胞中,应用CRISPR/Cas9技术敲除
GGCX基因;通过ELISA、DNA测序、Western印迹等方法鉴定
GGCX基因敲除的单克隆细胞。用快速点变异的方法构建致病性
GGCX变异体质粒;用ELISA方法检测
GGCX变异对报告基因的影响。
结果:首先用ELISA方法筛选到两株报告基因无活性的单克隆细胞;之后DNA测序结果和Western印迹验证
GGCX基因发生了编辑和敲除;最后通过转染野生型
GGCX基因,可以恢复报告基因的活性,提示成功筛选到两株
GGCX基因敲除的单克隆细胞。在筛选到的细胞株中转染已知可导致VKCFD1的
GGCX变异体,发现报告基因活性在致病性变异体中显著降低。
结论:成功构建了检测GGCX活性的细胞体系,该体系可以用于诊断
GGCX变异导致的VKCFD1。
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