氨肽酶PepN1在细胞外催化杀稻瘟菌素的成熟

[背景]肽核苷类抗生素杀稻瘟菌素(Blasticidin S,BS)生物合成途径的最后一步是亮氨酰杀稻瘟菌素(Leucylblasticidin S,LBS)水解成熟为BS,BS原始产生菌灰色产色链霉菌和异源表达菌株变铅青链霉菌W J2清洗过的细胞均能催化这一步反应.前期我们确定在这两种菌中都含有编码3个氨肽酶PepN同源蛋白的基因,其中编码产物PepN1主要负责水解LBS和亮氨酰脱甲基杀稻瘟菌素(Leucyldemethylblasticidin S,LDBS),且催化效率相当.但是,相比于原始产生菌只积累BS这一种组分,异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2还积累了LBS和LDBS,这意味着原始产生菌与WJ2中PepN1的水解活性存在差异.[目的]研究PepN1在两个菌株中的表达和分泌对BS组分的影响.[方法]利用PepN1的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)比较不同生长时间的原始产生菌和异源表达菌株在细胞内、细胞培养液中PepN1的表达水平.硫酸铵沉淀收集两种菌株培养液中的蛋白,通过Westemblot检测PepN1的存在并在体外检测水解活性.[结果]原始产生菌第2-6天细胞内PepN1水平基本没有变化,而异源表达菌株自第4天起细胞内PepN1开始减弱,到第6天完全消失;另一方面,Western blot在原始产生菌细胞培养液中检测到PepN1,而在异源表达菌株中却没有检测到.细胞培养液水解LDBS的活性与Western blot检测到的PepN1表达水平相一致.[结论]BS原始产生菌能持续表达合成PepN1并将一部分PepN1分泌到细胞外,而异源表达菌株WJ2从第4天起则停止合成PepN1,第2-6天的细胞均不能将PepN1分泌到细胞外,这导致WJ2中积累亮氨酰化的产物.两个菌株清洗过的细胞均可以水解LDBS和LBS,推测在WJ2体内消失的PepN1分泌到细胞壁上但没有释放到溶液中,这部分PepN1可以在WJ2中将部分LDBS和LBS水解成对应的DBS和BS.