长链非编码RNA HULC通过下调miR-29的表达促进肝细胞癌生长的机制

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)HULC通过下调微小RNA?29(miR?29)的表达促进肝细胞癌(HCC)细胞增殖的作用及分子机制.方法 运用实时荧光定量PCR法检测HCC组织和细胞中HULC和miR?29的表达水平,并进行相关性分析. HCC细胞转染HULC过表达质粒或以小干扰RNA(siRNA)敲低HULC的表达,以实时荧光定量PCR检测miR?29和靶基因SET结构域分支1 (SETDB1)的表达水平.通过生物信息学预测HULC序列上存在的miR?29结合位点,构建报告基因质粒与miR?29模拟物、miR?29抑制物共转染HCC细胞,通过双荧光素酶报告基因实验验证HULC靶向调控miR?29的分子机制.以细胞计数盒8(CCK?8)法检测miR?29对HULC的促HCC细胞增殖作用的影响.以实时荧光定量PCR法检测Ki?67的表达.建立Hep3B细胞移植瘤模型,瘤内注射miR?29模拟物、miR?29抑制物、miR?29阴性对照,观察肿瘤体积.采用免疫组化法检测小鼠肿瘤组织中肿瘤增殖抗原Ki?67的表达.结果 与癌旁组织和正常肝细胞比较,HULC在HCC组织和HCC细胞中均呈高表达(P＜0.01),而miR?29均呈低表达( P＜0.01),HULC和miR?29在HCC组织( r＝－0.754, P＜0.01)和HCC细胞(r＝－0.865,P＜0.05)中的表达均呈负相关.与空白对照组比较,过表达HULC组Huh7细胞中 miR?29 表达明显降低,而 miR?29 靶基因 SETDB1 mRNA 的表达升高( P＜0.01), si?HULC组Hep3B细胞中miR?29表达明显升高,而 miR?29靶基因 SETDB1 mRNA的表达降低(P＜0.01). miR?29模拟物可显著抑制转染psi?HULC?WT质粒组但不能抑制转染突变( psi?HULC?Mut)组Hep3B细胞的荧光素酶活性,而miR?29抑制物可拮抗miR?29模拟物对psi?HULC?WT荧光素酶活性的抑制作用(P＜0.01).与对照组比较,miR?29模拟物组Huh7细胞的增殖能力明显减弱.处理24、48和72 h后, HULC过表达组Huh7细胞的增殖率分别为(43.87±3.82)%、(83.45±7.46)%和(123.34± 8.67)%,与对照组[分别为(13.45±1.77)%、(23.54±1.37)%和(38.21±2.09)%]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).处理48和72 h后,转染miR?29模拟物组Huh7细胞的增殖率分别为(57.10±1.94)%和(73.76±3.46)%,与对照组[分别为(83.45± 7.46)%和(123.34± 8.67)%]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).处理48和72 h后,转染 miR?29模拟物+miR?29抑制物组 Huh7细胞的增殖率分别为(76.45±3.24)%和(89.37±4.37)%,与对照组[分别为(57.10±1.94)%和(73.76±3.46)%]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,转染48 h,转染miR?29模拟物Huh7细胞中Ki?67 mRNA的表达明显受到抑制(P＜0.01).转染miR?29抑制物Huh7细胞中Ki?67 mRNA的表达升高(P＜0.01).对照组、miR?29模拟物组和miR?29模拟物+miR?29抑制物组裸鼠移植瘤的肿瘤体积分别为( 504.0 ± 19.6)mm3、(310.0±24.3)mm3 和(483.7±21.2)mm3.与对照组比较,miR?29模拟物组的裸鼠成瘤能力明显降低(P＜0.01).与miR?29模拟物组比较,miR?29模拟物+miR?29抑制物组裸鼠成瘤能力增强(P＜0.01).对照组、miR?29模拟物组、miR?29模拟物+miR?29抑制物组荷瘤鼠肿瘤组织中Ki?67蛋白的吸光度值分别为0.65±0.08、0.36±0.07、0.56±0.06.与对照组比较,miR?29模拟物组Ki?67蛋白表达量明显降低(P＜0.01).与miR?29模拟物组比较,miR?29模拟物+miR?29抑制物组Ki?67蛋白表达量升高(P＜0.01).结论 lncRNA HULC通过分子吸附miR?29、并下调miR?29的表达促进HCC细胞增殖. HULC下调miR?29表达可能是其参与促进HCC生长的新机制.