基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术的诺如病毒RNA标准参考样品的研制

目的:针对目前检测领域缺乏诺如病毒(Norovirus,NoV)核酸标准样品这一瓶颈,基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型NoV检测靶标RNA的病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)标准参考样品.方法:人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型NoV检测靶标对应的cDNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII,将其克隆到pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-QINVGII.将pET-QINVGII转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后,利用氯化铯密度梯度离心,制备纯化VLPs,并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究.结果:SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.lkDa左右有目的条带表达;透射电镜下可观察到大量结构完整、直径约为25nm的VLPs.定值结果显示,制备的VLPs样品中GII型NoV检测靶标RNA的含量为(1.06 ±0.06)×107 copies/μl;均匀性分析结果表明样品均匀性良好,即F=2.24＜ F0.05(9,20);稳定性结果表明,制备的VLPs在37℃可保存12天、室温(20 ～25℃)可保存24天、4℃至少可保存90天、-20℃至少可保存200天、-80℃至少可保存300天.结论:基于Qbeta噬菌体制备的NoV装甲RNA均匀性和稳定性良好,拷贝数高,为NoV分子检测提供了良好的标准参考样品.