应用实时高分辨率熔解曲线技术检测巴尔通体

目的 应用实时高分辨率熔解曲线PCR技术建立特异性强、灵敏度高和稳定性好快速检测巴尔通体物种方法.方法 查找巴尔通体属特有基因ssrA特异引物进行常规PCR扩增,随后将扩增产物连接到pEASY(R)-T5 Zero克隆载体上制备标准品.优化扩增反应的退火温度和引物浓度,评估实时高分辨率熔解曲线方法的特异性、敏感性及重复性,并与常规PCR进行比较.结果 优化的退火温度为60℃,引物浓度均为300 nmol/L.特异性实验结果显示只有巴尔通体物种扩增出荧光信号,且相对应的熔解温度值为81.05℃±0.31,阴性对照菌株均未见荧光信号和熔解曲线;敏感性实验结果显示在20 μL的反应体系中,实时高分辨率熔解曲线方法检测汉赛巴尔通体物种最低检出限为3.82×101个拷贝,比常规PCR敏感性提高了100倍,此外也显示出良好的线性关系和扩增效率,相关系数R2分别为0.999,E值分别为98.4％.重复性实验结果显示组内和组间的变异系数值为0.30％～0.62％和0.29％～0.36％,在允许范围内.结论 建立的实时高分辨率熔解曲线PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速地检测鉴定巴尔通体物种,为巴尔通体所引起的猫抓病、战壕热、心内膜炎、杆菌性血管瘤和卡瑞恩病等一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段.