TaqMan探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的: 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体.方法:选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp.回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒.构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线.利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较.结果:支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg·L-1,A260/A280 (Ratio)为1.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝·μL-1.10 μmol·L-1的引物浓度和10 μmol·L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件.检测灵敏度为4.250×101 拷贝.拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式:Ct= -2.916×log拷贝数+40.02.特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好.准确性检测中变异系数小,表明稳定性好.组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好.样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法.结论:支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好.