微小隐孢子虫黏蛋白CGD5_2060原核表达及其黏附功能

从微小隐孢子虫cDNA中克隆黏蛋白cgd5_2060基因,并对其蛋白功能相关基序进行预测;构建原核表达载体pET32a-cgd5_2060,转化至大肠埃希菌Rosetta中,诱导表达并纯化重组蛋白CGD5_2060,制备鼠源多克隆抗体,并通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定其抗体效价;将纯化的重组蛋白CGD5_2060及载体对照蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法(Western blotting)与间接ELISA方法检测其细胞黏附特性.结果表明,CGD5_2060蛋白的1~19个氨基酸为信号肽,说明该蛋白是分泌型蛋白.使用PROSITE数据库分析发现:该蛋白含有1个富含苏氨酸的区域TTTTTTKSTTTTTTAVTT,位于510~527个氨基酸处;此外,还有1个与细胞黏附有关的序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),位于69~71个氨基酸处.上述结果表明,cgd5_2060基因可能与微小隐孢子虫黏附宿主细胞相关.原核表达的重组蛋白CGD5_2060具有良好的免疫原性,获得了较高效价的多克隆抗体.重组蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法与间接ELISA方法检测发现,CGD5_2060可以与Caco2细胞黏附.本试验为揭示微小隐孢子虫黏附细胞的机制提供了一定的理论基础.