siRNA 干扰绵羊胚胎成纤维细胞 Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率

在动物细胞中，抑制非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)修复途径，可以提高同源重组(Homologous recombination, HR)修复基因组双链断裂(Double-strand brakes, DSBs)的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的 HR 效率，针对 NHEJ 修复途径中的关键因子 Lig4(DNA ligase 4)基因，本文设计合成4个具有靶向性的 siRNA(Small interfering RNA)。绵羊胚胎成纤维细胞经电转染导入 siRNA，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和 Western blotting 检测，筛选出有效抑制 Lig4基因表达的2个 siRNA。应用质粒重连法检测HR 修复效率，将 I-SceⅠ酶线性化的 HR 质粒和 siRNA 共转染绵羊胚胎成纤维细胞，经72 h 培养及流式细胞仪检测，与对照组细胞比较，结果表明 HR 质粒重连效率提高了3~4倍。瞬间干扰 Lig4基因的表达可提高 HR质粒重连效率，为改善绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率提供理论基础。