家蚕核型多角体病毒lef-11基因RNA干扰策略的优化

[目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV) lef-11基因作为杆状病毒高度保守的晚期表达因子之一,对病毒晚期基因的表达极其重要.因此对lef-11基因进行有效RNA干扰将提高宿主细胞对BmNPV的抗性.[方法]本文基于经典的sh-RNA-loop骨架及家蚕内源性的miRNA骨架,构建以BmNPV lef-1基因为靶标的干扰载体pIZ-shRNA1、pIZ-shRNA2和pIZ-DsRed-amiR279;分别构建基于A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4和hsp70启动子驱动的干扰载体,用以评价不同启动子驱动的干扰载体的抗病毒效果,并对干扰载体进行优化.[结果]首先,本文通过比较miRNA-based和shRNA-based RNAi载体对同一靶基因同一位点的干扰效率,发现pIZ-DsRed-amiR279对BmNPV lef11基因的干扰效率超过90％,远优于shRNA-based RNAi载体的干扰效果;其次,通过对干扰载体进行优化,发现IE1启动子的效果最优,由其驱动的pIZ-DsRed-milef1 1干扰载体也是本研究中的最优干扰载体,对病毒的增殖抑制效果最为明显.[结论]对目的基因的干扰效果并非启动子的活性越高、miRNA积累得越多就越好,只有综合考虑干扰片段的选择、启动子的活性以及靶基因自身的功能等多方面的因素,才能提高干扰效率,达到干扰目的.