水稻N-糖酰胺酶基因(OsPNGase A)的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达

N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶.本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48％)的N-聚糖酶基因(OsPNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体pPICZ(α)A-OsPNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和HisTrap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg.SDS-PAGE结果显示,纯化的OsPNGase A为单一条带且与预期分子量一致.OsPNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F.OsPNGase A反应的最适pH和温度分别为pH 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性.水稻OsPNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGaseA的大量制备奠定了基础.