CRISPR/Cas9基因编辑技术构建靶向敲除小鼠微小RNA-101a基因的一体化载体系统

目的:利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建两种一体化载体,用于敲除AML12 细胞系中的微小RNA(microRNA, miR)-101a.方法:设计三条小鼠靶向miR-101a 基因的小向导RNA(sgRNA) 以及一条靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA,分别构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9),并将sgRNA1 和sgRNA3 构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EF1α-Cas9 D10A).在AML12 细胞系中转染构建的一体化质粒,72 h 后用T7 核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)检测剪切效率.将pENTRY 一体化质粒通过Gateway 的方式重组到pAD 载体中,再转染293A 细胞进行腺病毒包装.在AML12 细胞系中进行腺病毒感染,72 h 后检测miR-101a 成熟体的表达水平以评估敲除效率.结果:构建的pENTRY 一体化质粒经测序鉴定后正确.质粒转染AML12 细胞系后进行T7EⅠ检测,均发生了明显剪切形成了两条带,表明设计的sgRNA 有效果.pENTRY 一体化质粒重组到pAD 载体中,经酶切鉴定正确.腺病毒转染AML12 细胞系后,实时荧光定量PCR 检测表明细胞中miR-101a 成熟体表达水平较对照组均明显下降(均P <0.01).结论:构建了具有较高敲除效率的靶向小鼠miR-101a 基因的一体化载体系统,为后续微小RNA 功能研究奠定了技术支撑和实验基础,同时也为其他微小RNA 敲除提供了借鉴方法.