人胶质细胞源性神经营养因子基因修饰猴雪旺细胞的构建与鉴定

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(human glial cell derived neurotrophic factor,hGDNF)基因修饰的猴雪旺细胞稳定细胞系. 方法 以pUC 19-hGDNF为模板,扩增含hGDNF基因序列,将其插入质粒pBABE-puro,构建pBABE-puro-hGDNF重组真核表达载体,经酶切鉴定及DNA测序鉴定重组质粒.从恒河猴提取、培养、纯化雪旺细胞.包装病毒,利用含hGDNF基因的重组逆转录病毒转染雪旺细胞,实时荧光定量PCR、Western blot检测hGDNF mRNA及蛋白表达情况. 结果 PCR产物hGDNF基因编码序列大小约596 bp.重组表达载体经双酶切鉴定,含有1条596 bp的特异性条带,其基因测序结果与基因库中hGDNF基因序列片段相同,提示hGDNF基因成功转入逆转录病毒.逆转录病毒转染的雪旺细胞hGDNF mRNA及蛋白表达量显著高于未转染雪旺细胞,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 成功构建hGDNF基因修饰的猴雪旺细胞稳定细胞系,能长期稳定高效释放hGDNF,为进一步将其应用于神经损伤修复奠定了基础.