利用TaqMan-MGB探针检测A(H3N2)亚型流行性感冒病毒E119V耐药突变

目的 建立快速检测A(H3N2)亚型流行性感冒病毒(简称流感病毒)神经氨酸酶(M)基冈E119V奥司他韦耐药突变位点的双重实时荧光定量逆转录PCR(rRT-PCR)方法.方法 由GenBank获取2000-2012年A(H3N2)亚型流感病毒NA基因序列26条,据此设计特异性靶向NA E119V突变位点的TaqMan-MGB探针进行双重rRT-PCR反应,并利用耐药参考株、临床分离株进行敏感性、特异性和重复性评价.结果 建立了快速检测NA基因E119V位点的双重rRT-PCR检测方法.本方法在A(H3N2)病毒(HA=8)稀释度至10-5仍可检测到荧光信号,病毒滴度的对数与Ct值之间呈线性相关,具有较高的灵敏度；与无耐药突变的A(H3N2)流感病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,两条TaqMan-MGB探针之问不存在交叉反应,具有很高的特异性,并能够检测耐药株和敏感株混合病毒中的耐药突变,在较高浓度的混合病毒中对耐药突变的检测限是5％,在低浓度混合病毒中的检测限是50％.重复性试验得到H3N2-119E和H3N2-119V两组探针批内平均变异系数(CV)值分别为2.32％和0.57％,批间CV值分别为1.77％和0.97％,具有较好的重复性.对其中20株病毒的NA基因序列进行分析,证实这些毒株的NA基因119位点均为谷氨酸(E),表明本研究设计的方法与序列测定结果一致.结论 建立了基于TaqMan-MGB探针检测A(H3N2)亚型流感病毒E119V耐药突变的双重rRT-PCR方法,该方法灵敏、特异、重复性好,实验过程和结果判读简单易操作.