rAAV2VEGF165与rAAV2ANG-1联合转染促猪缺血心肌血管生成的研究

目的:探讨联合应用血管内皮细胞生长因子(VEGF165) 及血管生成素(ANG-1),对猪慢性缺血心肌中血管生成效应及心功能改善的影响.方法:完全腔镜下放置血管缩窄环于小型猪左冠状动脉回旋支(LCX),建立慢性心肌缺血模型.6周后行心电图、冠状动脉造影和心脏超声检查,确认LCX闭塞或相应心肌的缺血.16只动物随机均分为:单纯注射转染VEGF165组(组Ⅰ,n=4) 、单纯注射转染ANG-1组(组Ⅱ,n=4)、联合注射转染VEGF165与ANG-1组(组Ⅲ,n=4)和注射磷酸盐缓冲液PBS对照组(组Ⅳ,n=4).各组在胸腔镜下,心肌内直接注射rAAV2 ANG-1、rAAV2 VEGF165,剂量为5×1011 vg(virus/genome).治疗后,不同时间点ELISA检测VEGF165和ANG-1蛋白的分泌,冠状动脉造影观察侧枝循环形成的情况,行心脏超声检查观察左心室功能变化.3个月后取注射部位心肌,用Western blot检测VEGF165和ANG-1蛋白的表达情况,免疫组织化学观察心肌毛细血管密度与微小动脉生成情况.结果:放置血管缩窄环后6周,所有动物均出现LCX完全/次全闭塞,或LCX支配区域的心肌缺血.Ⅰ、Ⅲ两组猪体内的VEGF165蛋白分泌水平从基因转染后第7天开始上升,并于第14天达到高峰,随后逐渐下降,尤以Ⅰ组分泌水平为高;其它两组各时间点及组间的VEGF165蛋白分泌水平差异无统计学意义(P>0.05).同样,Ⅱ、Ⅲ两组猪体内的ANG-1蛋白分泌水平的变化与VEGF165蛋白分泌水平类似,尤以Ⅱ组分泌水平为高(P<0.01);其它两组各时间点及组间的ANG-1蛋白分泌水平差异无统计学意义;组Ⅲ中VEGF165与ANG-1蛋白水平变化同步.Western blot检测显示,基因治疗后3个月,组Ⅲ VEGF165、ANG-1蛋白水平都显著高于组Ⅳ(P<0.01),组Ⅲ与组Ⅰ间VEGF165蛋白表达无显著差异(P ＞0.05),组Ⅲ与组Ⅱ间ANG-1蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).基因治疗3个月后,组Ⅲ左心室室腔缩小,心肌收缩力增强,LCX及其分支较基因转染前增粗、迂回,左回旋支发出侧支,左回旋支远端重新有造影剂充填.组Ⅰ、Ⅱ则有不同程度心肌收缩力增强,充盈改善,但均较组Ⅲ改善幅度小,回旋支见少许造影剂充填,但较组Ⅲ明显少,组Ⅳ处理前后无明显改变.超声检查显示,模型建立术后6周,左心室下壁及后壁变薄,局部运动减弱、不协调,收缩异常;基因转染后1个月、3个月,组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ心功能都较转染前有明显改善,组Ⅳ无明显变化;组Ⅲ 的EF与FS改善程度要明显好于其他各组.CD34免疫组化染色评价血管密度,组Ⅲ缺血区血管计数高于组Ⅰ、组Ⅱ,差异有统计学意义(P<0.05),对照组Ⅳ的心肌内毛细血管数目很少.应用α-SMA免疫组化染色评价小动脉形成,结果提示,基因转染3个月后组Ⅳ心肌中小动脉密度最低,其余各组心肌中均有较多的小动脉新生,尤以组Ⅲ最为显著.结论:完全腔镜下放置血管缩窄环及完成心肌内注射切实可行,在胸腔镜下建立的小型猪慢性心肌缺血模型中,心肌内注射rAAV2 VEGF165 、rAAV2 ANG-1可以有效地转染小型猪心肌组织,外源基因长期稳定表达,同时ANG-1能协同VEGF165作用,从而显著地提高其促进缺血心肌毛细血管和小动脉生成,促进有效侧枝循环形成并改善心功能.