重组人核苷二磷酸激酶A的理化性质

对重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK-A)进行纯化,并对重组产物的理化性质及在溶液中的聚合状态进行鉴定.NDPK-A工程菌发酵后的菌体高压匀浆,然后微孔过滤、超滤浓缩,所得样品经DEAE阴离子交换、Cibacron Blue亲和层析、分子筛层析三步纯化后,以SDS-PAGE和RP-HPLC分析纯化产物的纯度,RP-HPLC测定酶活性.合格制品以基质辅助激光解析飞行时间质谱测定相对分子质量(MW);Edman降解法测定N末端序列;多角度激光散射法测定重组产物在溶液中的表观分子量.结果表明,rhNDPK-A纯化产物的SDS-PAGE纯度为97.3%,RP-HPLC纯度为99.2%;比活性为(900±100)u/mg;单体相对分子质量为17017,与NDPK-A分子量理论值相差132.测序结果表明,rhNDPK-A N末端缺失Met残基,其理论分子量为17017,与飞行质谱测定结果完全一致.表观分子量测定结果表明,rhNDPK-A在溶液中形成六聚体,表观分子量为102kD.上述结果说明, NDPK-A重组产物具与天然产物相同的自发形成六聚体性质,这为NDPK-A新药开发和机理研究打下了良好基础.