抗EGFR单链抗体融合gelonin毒素的原核表达体的构建及其生物活性研究

目的 构建表达抗表皮生长因子受体(EGFR)单链抗体融合gelonin毒素的原核表达载体,并初步验证其功能.方法 以抗EGFR单链抗体基因为模板,通过PCR及酶切连接将该基因定向克隆人含gelonin毒素的原核表达载体pET32a中,将该质粒转入BL21( DE3)中经异丙基疏代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到包涵体,通过变性、复性并进行阳离子交换层析得到较纯的目的蛋白（重组免疫毒素rEG蛋白）.对纯化的rEG蛋白用Westernblot检测其免疫学特性,用细胞免疫组化实验及MTT实验测定其靶向性及生物学活性.结果 经酶切及测序证实重组质粒pET32a-rEG构建成功.诱导得到的包涵体经变性、复性后使用阳离子交换层析而纯化得到rEG蛋白.纯化的rEG蛋白经Western blot鉴定,可以与兔抗gelonin血清特异性结合.经细胞免疫组化实验鉴定,rEG蛋白可以有效靶向EGFR阳性细胞,MTT实验也证实纯化的rEG蛋白能特异性抑制EGFR阳性表达的肺腺癌A549细胞的生长.结论 成功制备了高纯度、具有生物学活性的rEG免疫毒素,为进一步研究其生物学功能提供了条件及基础.