乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析

目的 确定乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(terminal protein,TP)抗α-干扰素(IFN-αt)的功能区域.方法 PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中,构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT.以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激,ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的表达,建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准.构建TP(包括Spacer区)基因缺失突变体重组真核表达载体,通过融合表达的多肽表位抗体,Western blot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达.重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞,转染后48 h给予终浓度为100 IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解细胞,通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用,并据此确定TP(包括Spacer区)抗IFN-α作用的功能区域.结果 获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT.转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强,且在IFN-α2a终浓度为100 IU/ml时达到最大.Western blot显示TP(包括Spacer区)各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白.共转染p6-16CAT及部分/全长TP的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下,胞内CAT值和对照组相比无显著差别,相反,全长TP+部分/全长Spacer使细胞内CAT值显著下降.结论 DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关.