血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的:利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒.方法:实验于2004-08/2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成.自真核表达载体pMD18-T-METH1中酶切出METH1基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-METH1.以pAd-METH1为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-METH1,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达,采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定.结果:①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1.②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasyMETH1.③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制.结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,制备高滴度重组病毒,为METH1基因功能研究奠定了基础.