Canstatin-N基因在Pichia pastoris中表达及产物活性分析

目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统胞内表达canstatin-N蛋白.方法:通过PCR DNA合成技术以及DNA的酶切和连接技术,除去pPIC9K分泌型表达载体的信号肽,并使其载体的多克隆位点的3'端融合his6纯化标签,获得新的载体pPIC9Ki.以含canstatin N 端序列的pET-CTN质粒为模版,PCR法扩增1～89个氨基酸的267 bp的canstatin的N 端基因片段,将其连接于pPIC9Ki的多克隆位点,获得重组表达质粒 pPIC9Ki-CTN-N,用电转法将 pPIC9Ki-CTN-N 转化 P.pastoris GS115,通过G418抗性筛选获得工程菌GS115(pPIC9Ki-CTN-N).通过摇瓶发酵甲醇诱导表达Canstatin-N蛋白.用蜗牛酶裂解P.pastoris细胞,SDS-PAGE分析蛋白表达情况,在鸡胚中进行活性分析.结果:在pAOX1的调控下,canstafin-N基因能在P.pastoris中经甲醇诱导表达,摇瓶发酵表达量为65mg/L,纯化的目的蛋白具有显著的抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用.结论:实现应用P.pastoris表达Canstatin-N蛋白,为Canstatin-N蛋白的规模化生产和进一步的药用研究奠定了基础.