Wistar乳鼠中脑黑质器官型脑片培养的实验研究

目的:探索Wistar乳鼠中脑黑质器官型脑片培养的方法,以更接近在体状态的体外培养方法研究PD的病因和发病机制.方法:Wistar乳鼠中脑黑质器官型脑片培养每只乳鼠在中脑黑质区切取300 μm脑片5片,置Millicell-CM微孔膜上和6孔培养板中培养.根据培养时间随机平均分为4组.培养24 h后加入终浓度为10 μmol/L Ara-C抑制胶质细胞的生长.将上述终止培养后的脑片分别进行原位冰冻切片和石蜡切片,再行常规HE染色、TH免疫组化染色;同时行TH原位免疫组化和透射电镜观察.结果:倒置显微镜观察,在7～8 天以后脑片的厚度由原来的350μm减为150μm左右.培养3 天后脑片中的细胞逐渐清晰可见.细胞呈圆形或三角形,大小不等,边界清楚完整.自培养第2 天开始在脑片腹侧正中裂隙中及脑片周围的沟裂中出现液体流动-"微血流"现象.组织切片观察可见,在整个培养过程中培养脑片的器官型细胞构架保持完好.HE染色可见各培养时间组神经元数量和形态结构正常.各时间组脑片中神经元的超微结构正常,胞浆内含有丰富的线粒体、粗面内质网、高尔基氏体和分泌颗粒,生物膜完整.结论:Wistar乳鼠中脑黑质器官型脑片培养是一种研究帕金森病发病机制的良好的方法.它可在有胶质细胞存在的状态下接受干预因素的影响,较之帕金森病的细胞模型更接近在体状态,而较之动物模型更容易控制非干预因素.活力检测显示,各时间组脑片中神经元的活力正常,生长状态良好.TH是DA神经元的主要标志.各时间组的TH阳性神经元数目及形态均无明显差异.说明该培养方法较好地保持了脑片中DA神经元的存活.