鸭乙型肝炎病毒YMDD突变株体外耐药模型建立

目的构建鸭乙型肝炎病毒(DHBV)YMDD点突变的复制质粒,研究其在鸡肝癌细胞中的复制及拉米夫定抗性。方法以广东樱桃谷鸭DHBV分离株为模板,将3631 bp的片段克隆至载体pBluescript II KS(+)中,构建含1.2倍病毒全基因的重组质粒,经PCR定点突变获得YMDD突变株。将构建质粒经FuGENETM 6瞬时转染鸡肝癌细胞,分析变异株的复制能力及拉米夫定耐药性。结果 PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定均证实成功获得1.2倍DHBV全基因YMDD突变质粒。Southern印迹杂交表明重组质粒转染细胞后可检测到病毒复制中间体;野生株的复制能力是突变株的2.7倍。拉米夫定对变异株的IC50=37.12±8.81 ng/ml,高于野生株的IC50=10.90±4.80 ng/ml。结论与野生株相比,YMDD突变株质粒体外复制活性减弱,对拉米夫定敏感性下降。