人GITR_(aa27-165)蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的:表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白,制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb)。方法:利用PCR从pGEMT-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,通过Profinity IMACNi-Charged Resin亲和层析柱进行纯化;纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果:构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体,原核蛋白hGI-TRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白,蛋白浓度为400mg/L,制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1∶1.6×105,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论:获得高纯度hGITRaa27-165蛋白,并制备特异性pAb,将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础。