HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gp120。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Westernboltting检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达。