pSecTag-EGFP真核表达载体的构建及其转染鸡胚胎成纤维细胞条件的优化

目的 构建含报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体pSecTag-EGFP,用以研究pSecTag/HygroB转染鸡胚胎成纤维细胞的转染效率,为目的基因的成功表达奠定基础.方法 用PCR方法克隆得到EGFP基因,通过酶切、连接、转化构建pSecTag-EGFP分泌型真核表达载体,设计优化实验,通过脂质体介导的方法转染鸡胚胎成纤维细胞,在荧光显微镜下直接观察该基因的表达.用Bradford法检测不同组合的细胞培养液中的EGFP蛋白的相对含量.结果 脂质体介导的方法能有效转染鸡胚胎成纤维细胞,实验中EGFP蛋白相对表达量随质粒量的增加而明显升高(P＜0.01).其中脂质体2μl、质粒1.0μg时目的蛋白相对表达量最高.结论 pSecTag-EGFP质粒构建成功,并成功优化了转染条件.