031 Mise au point d’immunomarquages de protéines de régulation du cycle cellulaire sur l’endothélium cornéen monté à plat

Matériels et Méthodes Protéines étudiées : 4 protéines d’expression reconnues (ZO-1 intra-membranaire, α actine cytoplasmique, hnRNPL et histone H3 nucléaires) et 8 autres déjà décrites dans l’endothélium dont 3 inhibiteurs du cycle cellulaires (P27kip1, P21, P16-INK4a) ; 3 marqueurs de prolifération (PCNA, MCM2, Ki67), 2 protéines du cycle cellulaire (cyclineD1, cyclineE). Des cornées humaines et porcines ont été utilisées fraîches et après organoculture à 31 °C. Fixateurs/perméabilisant testés : paraformaldéhyde (PFA), acétone, méthanol, éthanol, Hg ++, Zn ++, ac acétique, triton, sodium docécyl sulfate (SDS), seuls ou en combinaison. Un démasquage des épitopes par la chaleur, des agents biochimiques ou chimiques a été testé. Résultats Des marquages très différents étaient obtenus selon le type de fixation/perméabilisation/démasquage et selon l’état cornéen (frais vs en organoculture). Il ne semblait pas exister de protocole ubiquitaire pour tous les marqueurs. Pour hnRNP, la fixation par PFA1 % seul suffisait pour toutes les cornées. Pour H3 un post traitement par SDS était nécessaire. Pour ces 2 marqueurs, une fixation en PFA 4 % donnait des marquages très hétérogènes. L’expression de P27, P16, PCNA était observée dans les cornées fraîches et en organoculture mais leur localisation subcellulaire différait selon le protocole utilisé alors que MCM2 ne semblait pas exprimé. Discussion Les éléments limitants l’accès aux antigènes semblent nombreux spécifiquement pour l’endothélium cornéen intact. Nous insistons sur les possibilités d’erreur d’interprétation en cas de fixation/démasquage inadapté et sur la nécessité d’utiliser des contrôles (nhRNP, H3) avant de conclure à l’absence d’expression ou à une expression régionale au sein de l’endothélium. Conclusion L’utilisation de ces protocoles spécifiques devrait permettre une localisation précise des protéines du cycle sur un endothélium cornéen entier intact.