hTFPI-2基因重组腺病毒载体的构建和体外U937单核细胞的表达

采用AdMax系统以复制缺陷型腺病毒为载体构建含有人组织因子途径抑制物-2 (hTFPI-2)基因的腺病毒载体.用含EcoRI、SacI酶切位点的引物从pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒中PCR扩增目的基因hTFPI-2,然后以限制性内切酶EcoRI和SacI消化hTFPI-2基因片段及腺病毒穿梭质粒PDC316-IRES-EGFP,用T4连接酶连接形成重组穿梭质粒PDC316-IRES-EGFP-hTFPI-2,与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre用脂质体Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hTFPI-2.测序结果证明hTFPI-2序列正确,PCR、HindⅢ和Pac I酶切电泳证实腺病毒重组质粒Ad-hTFPI-2构建成功.经过扩增和CsCl结合法纯化后,利用穿梭质粒PDC316-IRES-EGFP中带有绿色荧光蛋白检测表达,测定病毒滴度为0.931×1012 pfu/ml.重组病毒Ad-hTFPI-2对U937单核细胞感染率为89.33%.感染重组病毒较未感染时的上清TFPI-2浓度上升7倍左右,且对胰蛋白酶和纤溶酶具有抑制活性.成功地构建了能高效在U937单核细胞中表达hTFPI-2基因的重组腺病毒载体,为TFPI-2抗动脉粥样硬化作用的研究奠定基础.